Expressão heteróloga e caracterização da (s) enzima (s) envolvidas na biotransformação de ácido ferúlico a 4-vinilguaiacol por Zygoascus ofunaensis 1A-14

Descrição

O 4-vinilguaiacol (4-VG) é um composto fenólico de grande importância para as indústrias farmacêuticas, de alimentos e de química fina devido ao seu odor característico de cravo e as suas propriedades antioxidantes e anticancerígenas. Atualmente, a demanda de 4-VG não é atendida pela extração a partir de plantas, e nem pela síntese química. Além disso, a síntese química gera preocupações com a segurança do processo e dos produtos obtidos. Uma alternativa economicamente rentável, segura e natural para a produção desse composto é através da bioconversão de ácido ferúlico (AF) a 4-VG por microrganismos. Na bioconversão, as enzimas descarboxilases do ácido ferúlico de diferentes espécies de bactérias, fungos filamentosos e leveduras catalisam a descarboxilação não oxidativa de AF a 4-VG. Nesse contexto, novas enzimas com potencial para serem utilizadas como biocatalizadores na produção deste composto a partir de AF são de grande interesse biotecnológico e econômico. Recentemente, foi identificado que a estirpe Pichia ofunaensis 1A-14 realiza a bioconversão de AF a 4-VG em meio mineral com concentração inicial de 700 mg L-1 de AF. Porém, os genes e as enzimas, codificadas por estes envolvidos nesta bioconversão ainda não foram descritos. Desse modo, no presente trabalho pretende-se identificar, analisar e caracterizar o gene e a enzima envolvidos na bioconversão de AF a 4-VG por P. ofunaensis 1A-14. Para isso, inicialmente será investigada a presença de enzimas de interesse nos extratos extracelular, intracelular e da parede celular de P. ofunaensis 1A-14. Além disto, serão avaliadas as condições de incubação que levem à melhor resposta em atividade catalítica, como por exemplo, os efeitos do pH e da temperatura. O gene responsável pela descarboxilação de AF a 4-VG será identificado, amplificado utilizando a técnica da PCR e sequenciado utilizando a técnica de Sanger. A sequência obtida será analisada utilizando ferramentas de bioinformática para anotação, análises comparativas com outras sequências de descarboxilases do AF disponíveis em bancos de dados públicos e para predição proteica. Paralelamente, linhagens recombinantes de E. coli e P. pastoris expressando de forma heteróloga as descarboxilases isoladas neste trabalho serão construídas. Posteriormente, estas serão purificadas e caracterizadas quanto ao tempo de atividade; efeitos do pH, da temperatura e de reagentes químicos; e principalmente, quanto a sua cinética e especificidade. Assim este projeto visa a bioprospecção, análise e produção de novas descarboxilases para que possam ser utilizadas na produção do composto fenólico de alto valor agregado 4-VG.