Abordagens Integradas para Retinose Pigmentar: Neuroproteção com Rutina e Restauração Funcional por Optogenética

Descrição

A retinose pigmentar (RP) compreende um grupo heterogêneo de doenças hereditárias da retina caracterizadas pela degeneração progressiva dos fotorreceptores e constitui uma das principais causas de cegueira hereditária e irreversível. A doença afeta aproximadamente 1 em cada 4.000 indivíduos, com mais de 1,5 milhão de pessoas acometidas em todo o mundo. Sua progressão é caracterizada inicialmente pela perda dos bastonetes, responsáveis pela visão noturna e periférica, seguida pela degeneração dos cones, que compromete progressivamente a visão central e pode culminar em cegueira funcional. Além das alterações genéticas primárias, a progressão da RP envolve mecanismos celulares e moleculares compartilhados por diferentes formas da doença, incluindo ativação microglial, neuroinflamação, estresse oxidativo, disfunção mitocondrial, gliose reativa, necroptose e alterações do microambiente retiniano. Apesar dos avanços recentes na compreensão das bases moleculares e genéticas da RP, as opções terapêuticas permanecem limitadas. A grande heterogeneidade genética constitui um obstáculo importante para estratégias exclusivamente baseadas na correção de mutações específicas. Nesse contexto, intervenções capazes de atuar sobre mecanismos comuns de degeneração podem representar alternativas aplicáveis a um espectro mais amplo de pacientes. Ao mesmo tempo, nos estágios avançados da doença, quando ocorre perda substancial dos fotorreceptores, tornam-se necessárias estratégias capazes de explorar os circuitos neuronais remanescentes para recuperar, ao menos parcialmente, a função visual. O presente projeto propõe, portanto, uma abordagem integrada para o estudo de estratégias terapêuticas aplicáveis a diferentes estágios da RP, organizada em dois eixos complementares: um **eixo preventivo/neuroprotetor**, baseado no emprego da rutina, e um **eixo restaurativo**, fundamentado na utilização de ferramentas optogenéticas. A integração dessas abordagens permitirá investigar tanto mecanismos capazes de retardar a progressão da degeneração retiniana quanto estratégias destinadas à restauração funcional após perda avançada dos fotorreceptores. No eixo preventivo, será investigada a rutina, um flavonoide com propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e neuroprotetoras. A escolha desse composto fundamenta-se em seu perfil farmacológico e em evidências experimentais de sua capacidade de modular processos relacionados à inflamação e ao estresse oxidativo. Estudos anteriores demonstraram que a rutina pode reduzir a peroxidação lipídica e a produção de espécies reativas de oxigênio, aumentar os mecanismos antioxidantes endógenos e exercer efeitos citoprotetores em diferentes modelos experimentais. Evidências obtidas especificamente em tecidos oculares também indicam a redução de marcadores inflamatórios e oxidativos e a preservação da estrutura retiniana. A eficácia da rutina será investigada por meio de abordagens complementares, tanto **in vivo** quanto **in vitro**. O modelo animal será o camundongo RD1 (Pde6b^rd1^), amplamente utilizado no estudo da RP e caracterizado por degeneração precoce e rápida dos fotorreceptores. A rutina será administrada por diferentes vias, incluindo administração subretiniana e sistêmica, permitindo avaliar seus efeitos sobre a preservação estrutural e funcional da retina. Entre os desfechos, serão analisados a espessura e a organização da camada nuclear externa, marcadores de inflamação e gliose, como GFAP, Iba1 e CD68, morte celular e necroptose, expressão de genes associados à inflamação e ao estresse oxidativo, e a função retiniana por eletroretinografia. Como modelo tridimensional **in vitro**, serão utilizadas as denominadas **fotoesferas**, desenvolvidas no Laboratório de Neurogenética da UFABC a partir de neuroesferas retinianas e enriquecidas em fotorreceptores. Diferentemente de culturas bidimensionais convencionais, essas estruturas preservam características de organização espacial e multicelular e permitem induzir, de forma controlada, processos associados à degeneração de fotorreceptores. A exposição das fotoesferas à luz intensa permitirá investigar mecanismos de morte celular e avaliar o potencial neuroprotetor da rutina em condições experimentais padronizadas. O modelo apresenta ainda vantagens de escalabilidade e reprodutibilidade e não depende do emprego de células pluripotentes ou de manipulações genéticas complexas, características que favorecem sua utilização em estudos pré-clínicos e na avaliação de compostos neuroprotetores. Resultados preliminares sustentam a viabilidade dessa estratégia. A administração subretiniana de rutina em camundongos RD1 resultou em preservação parcial da camada nuclear externa da retina. Paralelamente, o protocolo desenvolvido no laboratório permitiu produzir, de forma reprodutível, fotoesferas enriquecidas em fotorreceptores, com aumento consistente na expressão de rodopsina. Experimentos adicionais demonstraram que a exposição luminosa provoca redução da viabilidade celular e aumento da morte celular, particularmente em fotorreceptores, validando a estimulação luminosa como paradigma experimental de degeneração para esses estudos. O segundo eixo do projeto abordará estágios avançados da RP por meio de **optogenética**. Após a perda dos fotorreceptores, parte dos circuitos internos da retina permanece disponível para manipulação funcional. A proposta consiste em utilizar vetores virais adeno-associados (AAV) para promover a expressão seletiva de opsinas em células retinianas remanescentes. Serão empregadas opsinas como ChrimsonR, um canal catiônico ativado por luz vermelha, e eNpHR, uma opsina inibitória ativada por luz amarela. A combinação dessas ferramentas permitirá investigar a modulação de vias ON e OFF e a possibilidade de recuperar respostas funcionais à estimulação luminosa. Os experimentos optogenéticos serão conduzidos em animais RD1 em estágio avançado de degeneração. Vetores AAV contendo as opsinas serão administrados por via subretiniana ou intravítrea, utilizando promotores que favoreçam a expressão em populações celulares específicas. A recuperação funcional será investigada por abordagens eletrofisiológicas, incluindo registros em matrizes de multieletrodos (MEA), associadas a avaliações comportamentais de resposta visual. Dessa maneira, será possível determinar se a ativação optogenética de circuitos remanescentes é capaz de produzir respostas funcionalmente relevantes em retinas com degeneração avançada. Um aspecto central do projeto é a integração entre os dois eixos. A hipótese é que uma intervenção neuroprotetora precoce possa preservar a estrutura retiniana e melhorar o microambiente celular, potencialmente favorecendo intervenções restaurativas posteriores. Para investigar essa possibilidade, serão comparados grupos submetidos à rutina, à intervenção optogenética e à combinação das duas estratégias. Desfechos estruturais, moleculares, eletrofisiológicos e comportamentais permitirão avaliar os efeitos das intervenções isoladas e combinadas. Espera-se que o projeto produza uma caracterização funcional e molecular das fotoesferas como modelo tridimensional para investigação da degeneração de fotorreceptores, gere evidências sobre o potencial neuroprotetor da rutina e determine a capacidade de estratégias optogenéticas de promover recuperação funcional em estágios avançados da RP. No eixo preventivo, são esperadas redução de marcadores inflamatórios e do estresse oxidativo, preservação da camada nuclear externa e prolongamento da viabilidade dos fotorreceptores. No eixo restaurativo, espera-se que a expressão de opsinas em circuitos retinianos residuais permita recuperar as respostas à estimulação luminosa e melhorar os parâmetros funcionais e comportamentais. O projeto terá duração de três anos. No primeiro ano serão priorizadas a produção e validação das fotoesferas e a investigação da rutina no modelo RD1. No segundo ano serão implementados os experimentos optogenéticos e iniciada a análise da interação entre as estratégias preventivas e restaurativas. O terceiro ano será dedicado aos experimentos combinados, aos testes comportamentais, à integração e à validação dos resultados e à disseminação científica dos achados. A execução será realizada na UFABC, que dispõe de infraestrutura para biologia molecular, culturas celulares 2D e 3D, experimentação animal e registros eletrofisiológicos por MEA, além de plataformas multiusuárias e suporte técnico especializado. O projeto também se beneficia de colaborações internacionais, incluindo a interação com pesquisadores da University of Southern California e da University of California San Diego, contribuindo para a implementação de abordagens experimentais e para a inserção internacional da pesquisa. Em conjunto, o projeto busca estabelecer uma abordagem experimental integrada para a retinose pigmentar, contemplando desde a **preservação dos fotorreceptores em fases iniciais da doença até a restauração funcional de circuitos retinianos em fases avançadas**. A associação entre modelos animais e tridimensionais, neuroproteção, análise molecular e funcional e optogenética poderá contribuir para a compreensão dos mecanismos da degeneração retiniana e para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas com potencial translacional.