Atividades Ferro-redutase/NADPH-oxidase de Leishmania spp. como um Possível Alvo Quimioterápico Contra a Leishmaniose

Descrição

As estratégias para a triagem de um agente quimioterápico incluem metodologias que podem se basear em uma triagem fenotípica ou triagem baseada no alvo. A primeira consiste em uma abordagem com a finalidade de se investigar o efeito de compostos diretamente na viabilidade do agente patogênico. Já a triagem baseada no alvo é realizada através de uma busca racional contra um alvo definido de interesse. Na maioria das vezes, essa estratégia envolve uma proteína associada a uma via específica. Parasitos do gênero Leishmania são agentes causadores das leishmanioses, doenças tropicais infecciosas e negligenciadas que causam grandes prejuízos à saúde pública. A sobrevivência da Leishmania depende da transmissão zoonótica ou antroponótica entre o inseto vetor e um mamífero reservatório. Durante o ciclo de vida ocorre uma alternância entre as formas promastigotas, presentes no inseto vetor, e as formas amastigotas infectivas, que surgem a partir da diferenciação dos promastigotas metacíclicos no hospedeiro mamífero. Devido à toxicidade dos tratamentos atuais para as leishmanioses, é de extrema importância que haja novos estudos que visem alvos seletivos e um maior entendimento sobre a biologia do parasito, bem como a busca de novas terapias para as leishmanioses. Trabalhos recentes relacionam a importância da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS - do inglês, reactive oxygen species) em eventos de proliferação e diferenciação em Leishmania sp. Uma das principais enzimas responsáveis pela produção de ROS em diversos organismos é a NADPH oxidase (NOX). Recentemente, nós mostramos que a enzima ferro redutase (LFR1) de L. amazonensis , que atua na redução do Fe3+ para Fe2+, pode atuar também como uma NOX quando ativada por heme. Trata-se de uma enzima bifuncional, nunca antes descrita em nenhum outro organismo, que constitui uma nova fonte geradora de ROS em Leishmania. Além disso, observamos que esta enzima é importante para a diferenciação dos parasitos nas formas amastigotas, constituindo assim um potencial alvo terapêutico para bloquear o ciclo de vida da Leishmania. Nesse projeto, nós propomos duas estratégias para a busca de novos quimioterápicos contra a leishmaniose: 1) reposicionamento de fármacos a partir de um medicamento já licenciado e utilizado na clínica; 2) busca racional de uma nova entidade química a partir de ferramentas computacionais. Na primeira estratégia, nosso objetivo é investigar o efeito de inibidores de enzimas NOX, comercialmente disponíveis, tais como: VAS2870, GKT136901 e Setanaxib em ambas as atividades da LFR1 e o possível papel desses fármacos na proliferação, diferenciação e infecção desses parasitos. Para isso, iremos avaliar as atividades ferro-redutase e NADPH-oxidase da LFR1 de diferentes espécies de Leishmania, o crescimento celular e a viabilidade de formas promastigotas na ausência e na presença de diferentes concentrações dos inibidores de NOX. Investigaremos a capacidade desses inibidores atuarem contra a infecção de células fagocíticas, desafiando macrófagos infectados na presença e na ausência desses compostos, assim como a capacidade de bloquear a diferenciação de formas promastigotas para amastigotas. Na segunda estratégia, nosso objetivo consiste na utilização de ferramentas computacionais para realizar uma triagem virtual por docagem molecular. Essa técnica permite seleção criteriosa e racional de compostos capazes de interagir diretamente com proteínas específicas do agente patogênico. Nessa etapa, serão montadas as bibliotecas de ligantes, os quais serão classificados e parametrizados quanto às cargas e números de torções. Em seguida, as enzimas-alvo (LFR1) de diferentes espécies de Leishmania, L. amazonensis, L. braziliensis e L. infantum serão preparadas para obtenção do estado de protonação e assinalamento das cargas. Por último, serão realizadas as triagens virtuais com os compostos selecionados para as enzimas-alvo. Os compostos mais promissores serão selecionados para ensaios in vitro. O projeto encontra-se em execução no Laboratório de Bioquímica Redox (Lab-RedOx) do Departamento de Bioquímica (IQ), com financiamento da FAPERJ, a partir de recursos concedidos em dois editais: Auxílio ao Pesquisador Recém-Contratado (ARC), Processo nº 211.283/2019; e Programa de Apoio a Projetos Temáticos, Processo nº 211.388/2021. Resultados prévios com VAS2870 mostram que o inibidor foi capaz de modular ambas as atividades da LFR1, porém, indicam ausência de citotoxicidade em L. amazonensis durante 24h de tratamento. A modulação ocorreu de forma dual, com simultânea inibição da atividade NOX e estimulação da atividade ferro-redutase em concentrações menores do que 1 µM. Além disso, o VAS2870 inibe a diferenciação e interação desses parasitos na presença dos macrófagos. Esses resultados fazem parte da dissertação de mestrado de uma das alunas do grupo e está em fase de submissão para publicação.